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ELISA實(shí)驗(yàn)操作的顯色和比色詳解!
(一) 顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應(yīng),此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。
適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯se情況適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,及時(shí)判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深,再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色,顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行,顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺(tái)上,邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達(dá),隨即逐漸減弱,至2小時(shí)后即可*消退至無色。
TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間(12-24小時(shí))不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。
(二)比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn),需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中,才可進(jìn)行比色。
在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。 比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn),測(cè)讀底物孔(未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔)和空白孔(以鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔),以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。
其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn),以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進(jìn)行計(jì)算。
比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度(oplical density,OD),現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence,A),兩者含義相同。通常的表示方法是,將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角,如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm,表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
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