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BUNSEN 重點(diǎn)講談ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方案
一、雙抗體夾心法
1.測(cè)抗原
?、?將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
?、?加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
?、?加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
④ 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。
2.測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。
二、間接法測(cè)抗體
原理:為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。
操作步驟:
1.將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2.加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。
3.加酶標(biāo)抗抗體,可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4.加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。
優(yōu)點(diǎn)評(píng)估:只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗(yàn)的特異性。
三、競(jìng)爭(zhēng)法
1.測(cè)抗體
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,ELISA試劑盒或不易得到足夠的純化抗原時(shí),可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。
如抗原為高純度的,可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì),直接包被不易成功,可采用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,然后加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì),然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式,可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)??笻Be的檢測(cè)一般采用此法。
2.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定,可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少。
四、捕獲包被法測(cè)抗體
如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體,因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體,后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗,間接測(cè)定IgM抗體,必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,以除去IgG的干擾。
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