ELISA實驗要點：ELISA結(jié)果判斷-操作
 

　　ELISA試驗結(jié)果的判斷主要根據(jù)所做實驗的說明書進行,現(xiàn)一般按S/CO進行判斷,其中S為樣品吸光度,CO為K*陰性對照,K值依據(jù)所做實驗有所不同。

　　如果沒有光度計(酶標儀)靠肉眼判斷,則陰、陽性判斷主要靠經(jīng)驗。ELISA常用結(jié)果判定方法如下：

　　1、 定性測定

　　定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應的強度，其實質(zhì)仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。

　　在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。

　　(1) 間接法和夾心法

　　這類反應的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應后常可出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物(見3.6)。在用肉眼判斷結(jié)果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。

　　目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標本(sample，S)、陽性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。

　　a. 陽性判定值

　　陽性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標準。

　　用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng/ml.每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數(shù)(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX)，兩個平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個特定的數(shù)值(例0.400)，試驗才有效。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX;如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算： 陽性判定值=NCX+0.05 標本A值>陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。

　　根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。

　　b.標本/陰性對照比值

　　在實驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本(S)和陰性對照(N)的A值后，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人(patient)的縮寫，不應誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05(或其他數(shù)值)，則按0.05計算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

　　(2)競爭法

　　在競爭法ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應最為敏感。

　　競爭法ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。

　　a. 陽性判定值法

　　與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照A值，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml.每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX)，兩個平均數(shù)的差(N-P)必須大于一個特定的數(shù)值(例如0.300)，試驗才有效。3個陰性對照A值均應小于2.000，而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算×NCX;如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：

　　陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

　　標本A值≤陽性判定值的反應為陽性，A>陽性判定值的反應為陰性。

　　b. 抑制率法

　　抑制率表示標本在競爭結(jié)合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算：

　　抑制率(%)= (陰性對照A值-標本A值)×100%/陰性對照A值

　　一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，<50%為陰性。

　　2、定量測定

　　ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是的檢測區(qū)域。

　　測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān)。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線示例見圖4-2.注意圖中橫坐標為對數(shù)關(guān)系，這更有利于測定系統(tǒng)的表達。

　　新型酶標儀一般帶有自動軟件可進行定量分析。

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